W tym samym 1546 r. dobra pińczowskie powróciły do Oleśnickich, w osobie Mikołaja Oleśnickiego, potomka Jana Głowacza. Mikołaj dał się wkrótce poznać jako kontestator katolicyzmu i opiekun różnowierców. Żonaty z Zofią, córką Hieronima Szafrańca z Pieskowej Skały, starosty Chęcińskiego, wcześnie związał się z ruchem reformacyjnym, którego sympatykiem był jego teść. Dlatego tuż przed połową XVI w. pojawili się w Pińczowie pierwsi dysydenccy ministrowie, a nawet Andrzej Osiander, teolog protestancki na uniwersytecie w Królewcu.

Jesienią 1550 r. na zamku w Pińczowie znalazł schronienie Franciszek Stankar, popadły w herezję profesor języka hebrajskiego na Akademii Krakowskiej. Pod jego wpływem i namową Mikołaj zezwolił na odbycie w mieście zjazdu szlachty i duchownych protestanckich. Paulinów usunięto (przenieśli się do Wierciczowa), zaś wyposażenie kościoła spalono. 25 listopada odprawione zostało pierwsze publiczne nabożeństwo, według nowego obrządku, które celebrował Jakub Sylwiusz, duchowny nowej wiary. Od tego czasu stał się Pińczów głównym ośrodkiem reformacji w Małopolsce. (Jego pozycji nie naruszył nawet edykt królewski z grudnia 1550 r. skierowany przeciwko różnowiercom).

Najprawdopodobniej z inspiracji Stankara doszło do przekształcenia pińczowskiej szkoły parafialnej w gimnazjum protestanckie (1551 r.). Jego pierwszym rektorem został bakałarz Grzegorz Orszak, wychowanek uniwersytetu krakowskiego. Opiekę materialną zapewniał szkole Oleśnicki, ale z obowiązku tego wywiązywał się mało solidnie. Rozkwit szkoły nastąpił z chwilą przybycia do Pińczowa w 1556 r. nowego nauczyciela, Francuza, Piotra Statoriusza. Przysłał go tutaj ze Szwajcarii sam Jan Kalwin, na prośbę kalwinistów małopolskich. (Nauczyciel ten szedł do Polski na piechotę, wędrówkę rozpoczął w czerwcu i przemierzywszy 1500 km znalazł się jesienią w Pińczowie). Statoriusz zreformował szkołę, opracowując dla niej projekt organizacyjny o nazwie „Urządzenie Gimnazjum Pińczowskiego” .Opierając się na nim wprowadził podział na klasy, z których każda miała swojego nauczyciela i własny program nauczania. Oprócz łaciny uczono też języka greckiego oraz polskiego, któremu wyznaczono szczególną rolę. Dokładne przepisy regulowały tygodniowy rytm pracy szkoły i dyscyplinę uczniowską.

Oprócz wymienionych wcześniej profesorów w gimnazjum pińczowskim nauczali Jan Thenaud (Francuz), Melchior Filipowski z Krakowa, Krzysztof Przechadzka ze Lwowa (były uczeń szkoły),Marcin z Lublina (Lubelczyk), Erazm Gliczner, Franciszek Lismanin i Jerzy Szoman ze Śląska.

Gimnazjum cieszyło się w Rzeczypospolitej wielkim rozgłosem oraz wzięciem, z racji wysokiego poziomu nauczania. Czas zatarł nazwiska uczniów, ale o kilku pamięć przetrwała. Byli to: Justus Rabb (zm.1612), patrycjusz krakowski, późniejszy teolog i jezuicki pisarz polemiczny; Aleksy Rodecki (zm.1606), drukarz ariański w Krakowie i Rakowie; wspomniany już K. Przechadzka (zm.1589), działacz i pisarz reformacyjny; Stanisław Cikowski z Wojsławic (zm.1617), podkomorzy krakowski; Andrzej Cikowski, młodszy brat podkomorzego; nieznany z imienia syn Remigiusza Chełmskiego, jednego z pierwszych zwolenników kalwinizmu w Polsce; bliżej nieznany Krzysztof Bardzki, który dalszą naukę kontynuował w Szwajcarii. I być może Jan Łasicki (zm. 1599), historyk, bibliograf i polemista różnowierczy.

Po przeszło piętnastu latach istnienia gimnazjum pińczowskie zakończyło swoją działalność. Stało się tak na wskutek wielu niepomyślnych zdarzeń, zarówno dla szkoły, jak i dla miasta. Ale świetna tradycja nie została zapomniana. Toteż kiedy w czerwcu 1578 r. podjęty został ambitny plan powołania uniwersytetu protestanckiego, to na jego siedzibę wskazano Pińczów. Uczelnia miała mieścić się w budynku klasztornym, na co zgodę dał Jan Oleśnicki, syn Mikołaja. Rozpoczęto nawet zbiórkę pieniędzy dla realizacji zamierzenia, ale w tym czasie Pińczów kupił na prywatną własność biskup krakowski, miasto rekatolizował i szkoła wyższa w nim nie powstała.

Inną ważną instytucją, która działała w Pińczowie na potrzeby ruchu innowierczego, była drukarnia. Prowadził ją tutaj w latach 1558-1562 Daniel z Łęczycy. Opublikował w tym czasie 28 tytułów, w tym siedem po polsku. Drukował u Daniela nawet Andrzej Frycz Modrzewski, pisarz polityczny. Produkcja oficyny Pińczów w czasach reformacyjnej świetności wydawniczej podlegała cenzurze. Toteż gdy wydrukował bez jej aprobaty dziełko F. Stankara, zostało ono publicznie spalone w Pińczowie w dniu 1 września 1559 r.

Z książką związany był też Sebastian Pech, wędrowny księgarz, który czasowo osiedlił się w Pińczowie. Przywoził tu książki wydawane w Genewie, Zurychu, Bazylei. Jednocześnie zawoził do Szwajcarii korespondencję i studentów szkoły pińczowskiej, udających się na dalsze kształcenie do ośrodków zachodnioeuropejskich. Zachowały się też wiadomości o bibliotekach prywatnych, jakie mieli w Pińczowie działacze reformacyjni – Jan Łaski, Franciszek Lismanin, dziedzic Oleśnicki i Jerzy Szoman, który ożenił się w Pińczowie z szesnastoletnią mieszczką. Po ślubie wydał 30 dukatów na urządzenie domu, zaś 40 na książki. Nie zachowały się wprawdzie wzmianki o bibliotece szkolnej, ale jej istnienie jest raczej pewne. Były w niej głównie podręczniki, ułożone i używane w Szwajcarii romańskiej, wydawane przez nakładców francuskich. m.in. katechizm Kalwina. Na pewno księgozbiory posiadali też nauczyciele gimnazjalni, szczególnie Orszak i Statoriusz, którzy byli zaangażowani w tłumaczenie Biblii na język polski.

Przekład ten był największym przedsięwzięciem naukowym ośrodka pińczowskiego. Uczestniczyli w nim ponadto – J Łaski, F. Stankar, Jakub Lubelczyk i Andrzej Trzecieski Młodszy. Gotowe dzieło wydano za pieniądze Mikołaja Radziwiłła Czarnego w 1563 r. w Brześciu. (Stąd Biblia ta zwana jest brzeską lub Radziwiłłowską). Tłumaczenie zaliczane jest do najpiękniejszych w dobie polskiego renesansu.

Biblia odegrała też pewną rolę w dyspucie teologicznej, jaką przeprowadzili w Pińczowie Łaski ze Stankarem. Podobno w jej najgorętszym momencie „Łaski dał Biblią w łeb Stankarowi i dobrze mu głowy nie rozwalił”.

Dysputy miały miejsce w dawnym kościele klasztornym, zamienionym na zbór protestancki. Tu też odbywały się synody różnowiercze. (W sumie było ich 22). W synodzie czerwcowym roku 1559 uczestniczył Mikołaj Rejł Był on wtedy świadkiem, jak w świątyni odczytano publicznie (i po raz pierwszy) piękny wiersz Jana Kochanowskiego, zaczynający się od słów:„Czego chcesz od nas, Panie za twe hojne dary?” Legenda mówi, że Rej usłyszawszy ten utwór, miał przyznać Kochanowskiemu pierwszeństwo w poezji polskiej. Świadkiem naocznym tego wydarzenia, wspomnianego po wielu latach, był młodziutki Jan Zamoyski, późniejszy kanclerz i hetman koronny, który jako siedemnastolatek był obecny na tym synodzie. W tamtych latach przebywał w Pińczowie niezły poeta – Andrzej Trzecieski Młodszy (zm.1584 lub później). Pisał po łacinie, a po polsku głównie pieśni religijne przeznaczone dla zboru. W wierszach polskich uderza łatwość i prostota, a przykładem może tu być zwrotka

„Modlitwy, gdy dziatki spać idą”:

Już się zmierzka, nadchodzi noc,

Poprośmy Boga o pomoc

Aby on naszym strażem był,

Od złych czartów nas obronił,

Którzy najwięcej w ciemności

Używają swej chytrości.

Melodie do tych utworów pisał wybitny muzyk Wacław z Szamotu., zmarły w 1560r., najprawdopodobniej w Pińczowie. Po jego śmierci Trzecieski napisał sylwę zawierającą wers: „Nad falami Nidy jęczy pogrążony w smutku Trzecieski”, co może być pewną wskazówką co do miejsca zgonu i pochówka sławnego kompozytora.

Być może wiersze pisała także Zofia Oleśnicka. Przypisuje się jej bowiem autorstwo pieśni religijnej „Z ochotnem sercem Ciebie wysławiam Panie” (Wyd. w Krakowie w 1556 r.). Przypuszczenie takie nasunął akrostych zawarty w jej tekście, układający się w nazwisko: Zofia Oleśnicka z Pieskowej Skały. Na tej podstawie uznawano Zofię za pierwszą naszą poetkę, obecnie jednak uznanie to zostało zakwestionowane.

W r.1556 przybył do Polski wybitny reformator religijny Jan Łaski, który działał dotąd w Anglii, Danii i w Niderlandach. Zamieszkał najpierw u Dembińskich w Dębianach (parafia Sokolina, a więc blisko Pińczowa), a pod koniec życia przeniósł się na stałe do Pińczowa, który był zawsze terenem jego działalności. Tu też Łaski zmarł w styczniu 1560 r. Po uroczystym pogrzebie pochowano go obok ołtarza głównego w kościele pińczowskim, a na marmurze grobowym wyryto epitafium, ułożone przez Trzecieskiego: „Tu leży¸ Łaski; razem z nim złożono by tu i pobożność, gdyby i ona mogła kiedyś umrzeć”. (W późniejszym czasie, przy okazji restytucji katolicyzmu w Pińczowie, grób ten został zniszczony).

Około roku 1566-67 zmarli oboje Oleśniccy -Zofia i Mikołaj. Pińczów, pogrążony od dłuższego czasu w chaosie sporów religijnych, po rozłamie w zborze i secesji braci polskich, tracił na znaczeniu. Opuścił miasto drukarz Daniel, po odejściu Grzegorza Orszaka podupadła szkoła, ostatni synod odbył się tutaj w październiku 1563 r.; miasto zaczęło pustoszeć.

Spadkobiercy Mikołaja i Zofii -synowie Andrzej i Jan Oleśniccy -znaleźli się w poważnych tarapatach, bowiem Trybunał Lubelski przywrócił wygonionym paulinom prawa do utraconego niegdyś majątku. Jednocześnie sąd ziemski wiślicki obciążył braci sumą 2000 florenów, jako odszkodowanie za przywłaszczenie przez ich ojca skarbów klasztornych wsi Podłęże. By móc uregulować roszczenia, Oleśniccy sprzedali Pińczów w 1586 r. biskupowi Piotrowi Myszkowskiemu. W ten sposób przepadło dziedzictwo kardynała Zbigniewa i Jana Głowacza.

Z synów Mikołaja dzieci miał tylko Andrzej. Były to dwie córki oraz synowie: Jan, młodo zmarły dworzanin królewski, i Zygmunt, który umarł bezpotomnie. Tak więc na wnukach Mikołaja i Zofii skończyła się pińczowska linia rodu Oleśnickich.